آزمون تب زایی LAL
تب از علائم بیماری بوده و حالتی است که در آن دمای بدن جانداران خونگرم از مقدار طبیعی آن بیشتر شده و نقطه ثبت دمایی در مغز (set-point) جابهجا میشود.
در واقع، تب نوعی پاسخ دستگاه ایمنی بدن است که با افزایش دما قصد از بین بردن عوامل بیماری زا را دارد. اندوتوکسین، یک لیپوپلی ساکارید (LPS) از اجزای ساختاری غشای بیرونی باکتری های گرم منفی است که به گروه Pyrogen یا تب زاها تعلق دارد. اگر اندوتوکسین حتی به مقدار بسیار کم وارد جریان خون شود، باعث ایجاد علائم شدیدی از جمله التهاب، شوک و حتی مرگ میشود.
تب نشانه مبارزه بدن در برابر عوامل بیماریزا است و گاهی نیز پاسخ دمایی دستگاه ایمنی بدن نسبت به عفونتهای داخلی تلقی میشود. در واقع در گرمای حاصل از تب بسیاری از میکروبها توانایی رشد ندارند؛ نخستین پژوهش درباره دمای بدن در سال ۱۸۶۸ انجام گرفت و پژوهشگر آن، یک پزشک آلمانی به نام کارل وندریش بود. در انسان که میانگین دمای طبیعی بدن ۳۷ °C است، دمای برابر یا بیشتر از ۳۸°C در حالت استراحت؛ تب به شمار میآید. تب بیش از ۴۰C ° تهدید بزرگی برای جان انسان محسوب میشود، چرا که عملکرد آنزیمها و سایر پروتئینهای بدن را دچار اختلال میکند. آنزیمها کاتالیزگرهایی هستند که در واکنشهای زیستی مهم درون سلول و بدن مؤثرند.
چون این آنزیمها در دمای معینی فعالیت دارند و در دمای بالا از بین میروند، تب بالا با از بین بردن این آنزیمها، در واکنشهای زیستی بدن اختلال ایجاد میکند.
دمای بدن توسط هیپوتالاموس تنظیم میشود .عوامل تبزا)پایروژنها( موجب پاسخ و عملکرد هیپوتالاموس میشوند. عوامل تبزا میتوانند خارجی )همچون مواد سمی چون لیپوپلیساکارید موجود درغشای سلولی باکتریها (و یا داخلی) چون سیتوکینهای ترشحشده توسط فاگوسیتها( باشد.
ماکروفاژها با بیگانهخواری و هضم باکتریهای مولد عفونت، سم باکتری، موسوم به اندوتوکسین را آزاد میکنند. این مواد موجب ترشح موادی به نام اینترلوکین ،توسط ماکروفاژ میگردند. این ماده باعث میشود هیپوتالاموس، پروستاگلاندین بیشتری تولید کند. این ماده علت اصلی بروز تب است.
باکتریهای گرم منفی به عنوان یکی از علل مهم مرگ و میر شناخته شده اند. این باکتریها در لایه لیپوپلی ساکاریدی دیواره سلولی خود اندوتوکیسن دارند، آزاد شدن اندوتوکسین ناشی از لیز این باکتریها در خون منجر به ایجاد پاسخهای التهابی و دفاعی شدید در بدن شده و در صورت عدم درمان سریع و مؤثر منتهی به شوک عفونی و در نهایت مرگ بیمار میگردد.
در آزمون تب زایی نوعی پروتئین حاصل از تجزیه سلولهای خونی ) همولنف حقیقی ( خرچنگ نعل اسبی) مورد استفاده قرار می گیرد که این پروتئین حساسترین ماده شناخته شده در مقابل اندوتوکسین است.
کلیه محصولات حساس پزشکی و دارویی با وجود استریل کردن ممکن است حاوی دیواره سلولی (Endotoxin) باقی مانده باکتری های متلاشی شده باشند و واکنش تب زایی مثبت از خود نشان دهند. این موضوع به دلیل مقاومت و پایداری اندوتوکسین های باکتریایی می باشد. به همین خاطر کلیه محصولات حساس پزشکی و دارویی علاوه بر تولید در محیط اتاق تمیز مناسب طبق استاندارد محصول باید توسط روشی مناسب استریل و سپس مورد سنجش آزمون تب زایی قرار گیرند.
این عوامل تب زا به دلیل ایجاد حساسیت در بدن افراد به شدت میتوانند خطرناک باشند و حتی سبب مرگ فرد شوند. از این رو تشخیص آنها و انجام تست تب زایی قبل از استفاده از محصولات حوزه پزشکی ضروری است.
آزمون تب زایی
آزمون تب زایی و اندوتوکسین مطابق با استانداردهای بین المللی به دو روش ذیل انجام می شود:
- آزمون درون تنی (in-vivo) با تزریق نمونه به بدن خرگوش انجام می شود که کاملترین تست تب زایی بوده و برای همه محصولات پزشکی کاربرد دارد (تمامی عوامل تب زا). در این روش پس از تزریق عصاره نمونه به خرگوش، دمای بدن به صورت متوالی اندازه گیری و تغییرات در دمای بدن حیوان گزارش می شود.
- آزمون برون تنی (in vitro) با استفاده از کیت(LAL (Limulus Amebocyte Lysate انجام می شود که فقط برای یک سری از محصولات پزشکی کاربرد داشته (فقط اندوتوکسین ها) و روش سریع و صنعتی می باشد. در این روش عصاره سلول خونی Amebocyte خرچنگ نعل اسبی به عنوان مکانیسم دفاعی در برابر اندوتوکسین نمونه بسیار حساس است و با شناسایی آن پس از زمان مشخصی واکنش نشان می دهد
تست اندوتوکسین ( تب زایی ) به روش LAL
تست اندوتوکسین یا تست تب زایی طبق USP 41, 38 برای محصولات دارویی و برای تجهیزات پزشکی انجام میگیرد.
این امر در تست تب زایی موجب یک آبشار پروتئولیتیک میشود. آنزیم انعقادی که به وسیله یکی از فاکتورهای فعال شده و از یک آنزیم پیش انعقادی آزاد میشود، پروتئولیز کواگولوژن را در LAL کاتالیز میکند و قطعات به دست آمده که کواگولینها هستند، از طریق باند دی سولفیدی به طورخود به خودی به یکدیگر متصل میشوند و درنتیجه باعث کدورت LAL میشوند. در نهایت نیز یک لخته ژلی تشکیل میشود. تشکیل لخته پس از واژگونی لولیهای آزمایش به وسیله چشمی تعیین میشود.
به طور كلي برای تست اندوتوکسین یا تب زایی باید بدانید که اندوتوكسين ها بخشهايي از ديواره سلولي باكتريهاي گرم منفي هستند که از اوايل دهه ۱۹۰۰ميلادي به خاطر اثرات گرمازايي خود (تب القايي) شناخته شدهاند و اهميت آنها به علت تاثير بر سيستم ايمني ميباشد.
اندوتوكسين ها اغلب به خاطر ساختار خود كه شامل يك بخش ليپيدي (چربي، بخش تحريك كننده سيستم ايمني، داراي كمترين تنوع) و يك بخش پليساكاريدي (بخش متمايز كننده هر سويه، داراي تنوع بالا در طول زنجيره) ميباشند، ليپو پليساكاريد LPS ناميده ميشوند.
توکسین ها معمولاً در فاز لگاریتمی (Exponential growth) رشد باکتری ها ترشح می شوند و قاعدتاً هم از باکتری های زنده تولید می شوند اما همانطور که گفته شد در برخی موارد مانند باکتری دیفتری ، توکسین پس از لیز باکتری در محیط آزاد میشود.
در تست اندوتوکسین یا تب زایی به روش LAL غلظت بحرانی برای اندوتوکسین ها در سیستمهای آزمون برونتنی، بر اساس سیستمی که به کار میروند متغییر است. مقدار ۰٫۰۱ng اندوتوکسین، IL-1 و TNF را در ماکروفازهای انسانی فعال میکند. در حالی که مقدار ۰٫۰۴۸ng اندوتوکسین، پاسخهای زیستی نامحسوسی را در سلولهای دندریتیک انسان یا سلولهای تک هستهای خون محیطی القا میکند.
تست تشخیص تبزایی به صورت Invivo و اغلب به شیوه LAL Gel-clot انجام میگیرد. در تست اندوتوکسین (تب زایی) به روش LAL، اندوتوکسینها فاکتوری را در عصاره خونی آبی رنگ خرچنگ نعل اسبی limulus amebocyte lysate (LAL) فعال میکنند.
توضیحات بیشتر:
فارماکوپه ایالات متحده (USP) یک فارماکوپه (مجموعه ای از اطلاعات دارو) برای ایالات متحده است که هر ساله توسط کنوانسیون داروسازی ایالات متحده (معمولاً USP نیز نامیده می شود) منتشر می شود، یک سازمان غیر انتفاعی که صاحب علامت تجاری است و همچنین دارای حق کپی رایت است. خود فارماکوپه USP در یک جلد ترکیبی با فرمول ملی (یک فرمول) به عنوان USP-NF منتشر شده است. اگر یک ماده یا محصول دارویی دارای استاندارد کیفیت USP قابل اجرا (در قالب یک مونوگراف USP-NF) باشد، برای استفاده از نام “USP” یا “NF” باید مطابق باشد. داروهای مشمول استانداردهای USP شامل داروهای انسانی (تجویز شده، بدون نسخه یا در موارد دیگر) و داروهای حیوانی است. استانداردهای USP-NF نیز در قوانین فدرال ایالات متحده نقش دارند. دارویی یا ماده ای با نامی که در USP-NF به رسمیت شناخته شده است در صورتی تقلبی در نظر گرفته می شود که استانداردهای تطبیقی از نظر قدرت، کیفیت یا خلوص را برآورده نکند. USP همچنین استانداردهایی برای مکمل های غذایی و مواد غذایی (به عنوان بخشی از مواد شیمیایی مواد غذایی کدکس) تعیین می کند. USP هیچ نقشی در اجرای استانداردهای خود ندارد. مسئولیت اجرای آن بر عهده سازمان غذا و داروی آمریکا (FDA) و سایر مقامات دولتی در ایالات متحده است.