آزمون سمیت زایی
یاخته یا سلول واحد بنیادین ساختاری و کارکردی همه اندام ها) ارگانیسمهای موجودات زنده است. یاخته به زبان سادهتر واحد ساختار و عمل در جانداران است.
میتوان گفت چنانچه بدن موجودات را به یک ساختمان تشبیه کنیم سلولها به تعبیری آجرهای تشکیلددهندهی بنا هستند. هر سلول از اجزای مختلفی تشکیل شده است که به طور عمده سیتوپلاسم، غشای سیتوپلاسمی و هسته شامل میشود .
سیتوپلاسم مایع غلیظی است که حاوی مواد مختلف از جمله آنزیم هاست.
هستهی هر سلول در واقع نقش مدیریت تغییرات شیمیایی که درون سیتوپلاسم رخ میدهد را بر عهده دارد. هر سلول دارای یک هسته است که معمولاَ کروی بوده و به وسیلهی سیتوپلاسم احاطه شده است.
تعیین مرگ سلولی را میتوان با روشهای مختلفی مشخص نمود. برای اینکار بهتر است مراحل مختلف زندگی
سلولها را بشناسیم. به زبان ساده در صورتیکه سلول مورد بررسی نظیر سلولهای بافتهای مختلف غیر از خون یک سلول چسبنده (Adherent) باشد، برای زندهماندن و رشد و تکثیر باید حتماَ به یک سطح مناسب بچسبد. سپس به دور خود یک قلمرو ایجاد کرده تا مواد غذایی را دریافت کند. پس از آن رشد میکند و در
نهایت تکثیر میشود. عدم چسبندگی آن به ظرف کشت نشاندهنده رفتار غیر عادی سلول است که میتوان آنرا به سادگی با میکروسکوپ نوری در آزمایشگاه کشت تشخیص داد. در بسیاری از مواقع سلولهای مرده به صورت ذرات سیاهرنگ و شناور دیده میشوند. با اینحال هیچگاه نمیتوان به طور قطعی اشاره کرد که اگر سلولی گرد باشد لزوماَ مرده است زیرا سلولها در هنگام تکثیر معمولاَ مورفولوژی کروی پیدا میکنند و سپس
تکثیر میشوند. بنابراین نیاز به آزمایشهای تکمیلی وجود دارد .
سمیت سلولی به عنوان اولین آزمایش برای ارزیابی زیستسازگاری یک بیومتریال )زیست مواد، یا Biomaterial) شناخته میشود. بنابراین پاسخ مثبت در سمیت سلولی نشاندهنده عدم زیستسازگاری بیومتریال است. مرگ سلولی مرحله نهایی آسیب سلول است. درصورت تداوم آسیب به سلول، آسیب غیرقابل
برگشت میشود. در این حالت امکان بهبودی سلول وجود نداشته و سلول میمیرد .
جهت بررسی اثر)سمیت سلولی( ترکیبات بر رشد و تکثیر سلول ها و تعیین IC50 (مقدار دوز ماده که سبب
مرگ ۵۰ درصد سلولها میشود) این ترکیبات، از روش رنگ سنجی MTT استفاده میشود. پودر MTT یک نمک تترازولیوم محلول در آب است و هنگامیکه این ترکیب در محیط کشت فاقد فنول قرمز با بافر PBS حل می شود، ترکیب زرد رنگی ایجاد می کند. اساس این تست شکستن نمک MTT توسط آنزیم سوکسینات دهیدروژناز میتوکندریایی سلولهای زنده است. نتیجه این فعالیت ایجاد بلورهای نامحلول فورمازان ارغوانی رنگ است که توسط دی متیل سولفوکساید (DMSO) به صورت محلول در می آیند. هرچه سلولها فعالتر و تعدادشان بیشتر باشد میزان رنگ ایجاد شده بیشتر است. جذب نوری رنگ ارغوانی ظاهر شده در طول موج ۴۹۰-۵۴۰ نانومتر با استفاده از دستگاه الیزا ریدر اندازه گیری میشود .
این آزمون به دو صورت تماس مستقیم Direct Contact و یا عصاره extract بر روی سلولهای
کشت داده شده انجام میپذیرد.
آزمون سمیت زایی مطابق استاندارد بین المللی ISO 10993-5
استاندارد ISO 10993-5 که توسط سازمان استاندارد بین المللی (ISO) تهیه شده است، الزامات و روشهای آزمون را برای ارزیابی سمیت سلولی آزمایشگاهی دستگاههای پزشکی فراهم میکند. این روشهای آزمایشی به گسترش سلولهای کشت شده در تماس با دستگاه یا عصارهای دستگاه، به طور مستقیم یا به روش انتشار اشاره دارد. این روشها برای تشخیص پاسخ بیولوژیکی سلولهای پستانداران در شرایط in vitro با استفاده از پارامترهای بیولوژیکی مناسب طراحی شدهاند.
در کشور ما ، این استاندارد توسط موسسه استاندارد ترکیه (TSE) با عنوان زیر منتشر شده است
: EN ISO 10993-5 ارزیابی بیولوژیکی دستگاه های پزشکی – قسمت ۵: آزمایشات سمیت سلولی آزمایشگاهی.
آزمایش سمیت سلولی در شرایط آزمایشگاهی بسیار کاربرد دارد و به طور گسترده ای در ارزیابی طیف وسیعی از دستگاهها و مواد مورد استفاده قرار میگیرد. بنابراین به جای ارائه یک آزمایش واحد، در این قسمت از استاندارد ISO 10993 ، طرحی برای آزمایش تعریف شده است. روندی متشکل از چندین مرحله در تصمیمگیری دنبال میشود. به این ترتیب مناسب ترین روش آزمون انتخاب میشود.
سه دسته آزمون در استاندارد ISO 10993-5 ذکر شده است: آزمون عصاره، آزمون تماس مستقیم و آزمون تماس غیرمستقیم. انتخاب یک یا چند مورد از این روش های آزمون به ماهیت نمونه مورد ارزیابی، کاربرد بالقوه و ماهیت آن بستگی دارد. این انتخاب سپس جزئیات تهیه نمونه های مورد آزمایش ، آماده سازی سلول های کشت داده شده و نحوه قرار گرفتن سلول ها در معرض نمونه ها یا عصاره آنها را تعیین میکند.
وقتی زمان قرار گرفتن در معرض پایان یافت، حضور و میزان اثر سیتوتوکسیک ارزیابی میشود. هدف این قسمت از استاندارد ISO 10993 باز گذاشتن انتخاب نوع ارزیابی است. چنین استراتژی مجموعهای از آزمایشات را ارائه میدهد که نشان دهنده رویکرد محققان حمایت از آزمایش بیولوژیکی آزمایشگاهی است.
روشهای متعدد و نقاط انتهایی اندازه گیری شده در تعیین سمیت سلولی به شرح زیر دسته بندی می شوند:
- ارزیابی آسیب سلول از طریق مورفولوژیک
- اندازه گیری آسیب سلول
- اندازه گیری رشد سلول
- اندازه گیری جنبه های خاص متابولیسم سلولی
روشهای مختلفی برای تولید نتیجه در هر یک از این چهار گروه وجود دارد..